基因合成是指在體外人工合成雙鏈DNA分子的技術(shù)?；蚝铣墒怯萌斯し椒ê铣苫虻募夹g(shù)，是基因獲取的手段之一，相對于從已有生物中獲取基因來說，基因合成無需模板，因而不受基因來源限制。

 

什么是基因合成

 

基因合成是依照某一蛋白質(zhì)的基因序列，設(shè)計合成相互重疊的單鏈寡核苷酸，再通過重疊延伸PCR法拼接出全長，基因合成無需模板，是獲取基因的手段之一以提高在異源宿主的表達(dá)量行全基因合成，目前該技術(shù)主要應(yīng)用在基因的異源表達(dá)上，對基因密碼子優(yōu)化后進(jìn)。

 

此外，基因合成技術(shù)還用于合成一些不易獲取模板的基因或者自然界不存在的新基因等?；蚝铣杉夹g(shù)可以按照人們的意愿設(shè)計且靈活地合成，正好符合了當(dāng)代生物學(xué)發(fā)展的潮流，將會在越來越多的領(lǐng)域得到應(yīng)用，并且發(fā)揮巨大的作用。

 

基因合成的方法主要有組裝PCR重疊延伸PCR、TBIO法、PTDS法等。困擾全基因合成技術(shù)的問題主要有2個：①合成基因中堿基錯誤率高。②合成成本高。

 

在基因合成前，為使基因在不同生物表達(dá)體系中都能得到良好表達(dá)，研究人員通常會對基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。遺傳密碼有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些???碼子中的一部分，那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子。

 

實際上用做蛋白表達(dá)或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細(xì)胞，植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子偏愛性，因此，重組蛋白的表達(dá)可能受密碼子利用的影響(尤其在異源表達(dá)系統(tǒng)中)。

 

在不改變其編碼蛋白的情況下，對一個蛋白的編碼基因進(jìn)行改變，去除稀有密碼子，合理優(yōu)化其mRNA二級結(jié)構(gòu)，GC含量等的過程叫密碼子優(yōu)化。密碼子優(yōu)化的原理即根據(jù)將要使用的表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏愛性，針對目標(biāo)蛋白序列中的每一個氨基酸選擇不同的密碼子進(jìn)行全序列的組合，找出其中*的一條。

 

1、引物合成

 

研究人員根據(jù)自己的意愿確定合成的基因序列后，由于沒有模板，首先需根據(jù)待合成的雙鏈DNA設(shè)計引物、合成引物。引物，又名引子，是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點，在核酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈。

 

在PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)中，已知一段目的基因核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，如此重復(fù)循環(huán)，延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合。

 

簡單地說，引物即是短的單鏈DNA或短的RNA鏈，序列長度一般為15～90nt(nt為引物堿基單位，有些也用nt或bp標(biāo)識)，一般不超過120nt。目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應(yīng)物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA偶聯(lián)在固相載體上完成DNA鏈的合成的，引物合成的方向依據(jù)既定引物序列由3'端向5'端延伸，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。

 

2、引物互為模板PCR擴(kuò)增

 

引物合成后，引物之間互為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

 

PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

 

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;

 

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;

 

③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。

 

重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

 

 

3、連接轉(zhuǎn)化、菌檢送測

 

通過PCR反應(yīng)，可擴(kuò)增出我們需要的雙鏈DNA。但PCR產(chǎn)物穩(wěn)定性較低，我們需將連接到質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)中，涂平板過夜培養(yǎng)。第二天早上就可以從平板中挑選陽性克隆，挑到的克隆需要再次使用菌落PCR驗證是否有全長的基因插入，使用首尾引物進(jìn)行PCR，如果有產(chǎn)物，說明有目的基因。將驗證過的克隆轉(zhuǎn)化進(jìn)入試管培養(yǎng)搖菌，之后，抽提質(zhì)粒，純化送去進(jìn)行測序。

 

4、一代測序

 

目前，我們采用的是一代測序，也叫sanger測序。Sanger法測序利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入*的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。

 

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。

 

它們具有共同的起始點，但終止在不同的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。

 

5、QC驗證

 

將測序結(jié)果與目標(biāo)基因進(jìn)行比對，同時進(jìn)行QC酶切驗證，如果測序結(jié)果與酶切驗證結(jié)果均正確，就完成目的基因的合成了。按照上述步驟，順利的情況下5天時間就能合成出一段800bp左右的基因序列。

 

目前，基因合成周期短，同時可以保證序列的100%正確無誤，具有很大的靈活性，可以對基因的酶切位點和基因序列進(jìn)行修改，方便下游的克隆和實驗;研究人員根據(jù)自己的意愿設(shè)計得到自然界中很難獲得甚至不存在的基因;基因合成的基因可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使基因在各種生物表達(dá)體系中都能得到良好表達(dá)。

 

這些優(yōu)點使得基因合成在生物領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用，比如克隆人鼠抗體或重組抗體、合成不同的基因突變株、SNPS或其他突變株、設(shè)計合成DNA疫苗、大量合成用于微芯片的cDNA等?；蚝铣杉夹g(shù)的發(fā)展使生物領(lǐng)域又上了一個新臺階。

 

基因合成產(chǎn)業(yè)

 

美國基因合成產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)，有賴于發(fā)達(dá)的生物產(chǎn)業(yè)，政府與企業(yè)在基因業(yè)務(wù)上投入比較大，而國內(nèi)大批量投入的科研產(chǎn)業(yè)少，基因合成市場有限，客戶主要是科研單位。未來中國的基因合成產(chǎn)業(yè)，很大程度上受到國家對生物產(chǎn)業(yè)的政策引導(dǎo)的影響。

 

國外分析機(jī)構(gòu)的數(shù)據(jù)顯示，2014年全球包括工業(yè)級和科研級在內(nèi)的合成基因市場規(guī)模為20億美元，其中中國1.2億美元，僅占6%。這個小數(shù)據(jù)表明，國內(nèi)生物產(chǎn)業(yè)自己研發(fā)的東西太少，大部分國內(nèi)生物制藥企業(yè)，還是持續(xù)依靠復(fù)制國外技術(shù)，甚至等技術(shù)過期后直接拿來用，這樣并不需要合成基因。

 

因為合成基因只有在前期研發(fā)的時候才有較大的應(yīng)用空間，如果研發(fā)投入少，基因合成出來沒有消耗的市場，投入相應(yīng)就會小很多。國內(nèi)生物制藥企業(yè)長期只是模仿，路會越走越窄，發(fā)展到一定程度就會遇到很大的瓶頸。

 

 

從另一方面看，各國的生物產(chǎn)業(yè)都受到一定的限制，這是由行業(yè)特征決定的：生物產(chǎn)業(yè)是一個長期投入、高投入、成功率不高的產(chǎn)業(yè)，不像其他行業(yè)那樣能更快地產(chǎn)業(yè)化。

 

經(jīng)過十幾年的發(fā)展，整個基因合成行業(yè)已經(jīng)很成熟，然而，也引發(fā)了一系列行業(yè)問題。由于進(jìn)入門檻低、競爭無序，國內(nèi)企業(yè)不得不憑借國內(nèi)人力成本低的優(yōu)勢，趨向到國外接單、國內(nèi)合成的業(yè)務(wù)。

 

基因合成入行門檻不高，一些小的公司買一臺儀器，三四個人就可以從事這項工作，一個人去跑市場，攢夠訂單后就能開機(jī)。

 

基因合成行業(yè)拼的主要是儀器的通量。企業(yè)開機(jī)一次合成低于1000條BP是虧錢的，大規(guī)模、大通量才可以降低成本。

 

擠入這個行業(yè)者眾多，但基因合成技術(shù)還處于1.0版本，合成能力有限、合成周期較長、通量不高，因此，成本高。合成價格對于需求方而言仍然昂貴，也是國內(nèi)基因合成產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢的主因之一。